Membre de l'Académie des inscriptions (1838), il fut nommé en 1844 à la commission chargée de continuer l'Histoire littéraire de la France. C'est alors qu'il commença ses recherches sur l'origine et l'évolution de la langue française. Sa rencontre, la même année, avec Auguste Comte fut également déterminante. Il devint un fervent adepte du positivisme, dont il sera en France le véritable initiateur (Conservation, révolution et positivisme, 1852 ; Auguste Comte et la Philosophie positive, 1863). En 1867, il fonda avec Wyrouboff la Revue de philosophie positive, dans laquelle il écrivit un article retentissant sur les Origines organiques de la morale (1870). En particulier, il appliquera le positivisme à la linguistique. Sa rectitude intellectuelle l'empêcha cependant d'adhérer au mysticisme de Comte.
Après la révolution de 1848, il devint membre du Conseil municipal de Paris. C'est en 1863 qu'il commença la rédaction de son œuvre capitale : le Dictionnaire de la langue française (1863-1873) – ce qui provoquera la démission de l'Académie de Mgr Dupanloup (1802-1878) –, aboutissement d'un projet évoqué avec Louis Hachette dès 1841. Fasciné par les mots, « monnaie de l'esprit », il va dès lors s'acharner, pendant près de dix ans, à décrire l'histoire de leur sens et de leur « circulation ». Membre de l'Académie française en 1871, il est élu la même année député de la Seine et, en 1875, sénateur inamovible. Menant une existence ascétique – comme en témoigne sa conférence de mars 1880, Comment j'ai fait mon dictionnaire de langue française –, il travailla sans répit, jusqu'à sa mort, à ses travaux de linguiste et de philosophe.
Traduction des œuvres d'Hippocrate (1839-1861). Traduction de la Vie de Jésus de Strauss (1839-1840). De la philosophie positive (1845). Conservation, révolution et positivisme (1852). Auguste Comte et la philosophie positive (1863). La science du point de vue philosophique (1873). Dictionnaire de médecine et de chirurgie (1862, en collaboration avec Ch. Robin). Histoire de la langue française (1862). Dictionnaire de la langue française (1863-1873 ; supplément en 1878), ouvrage connu depuis sous le nom de son auteur : le Littré.