Le pouvoir séparateur intrinsèque du microscope est fonction de la longueur d'onde λ de la lumière utilisée et vaut 1,2λ(2n sin U), où U est le demi-angle d'ouverture du faisceau incident utile et n l'indice du milieu qui sépare l'objet de l'objectif. Pratiquement, on ne peut avoir une image nette d'un objet de dimension inférieure à la longueur d'onde de la lumière, quel que soit le grossissement de l'appareil optique employé.